化妆品抗污染功效与体外评价分析

近年来，全球城市化及工业化进程明显加快，空气污染比较严重，已经成为危害人体健康的重要公共卫生问题。室外空气污染物成分主要包括颗粒物（Particulate matter，PM）、二氧化硫、二氧化氮、臭氧及一氧化碳，其中PM2.5仍是当前我国绝大多数城市的主要空气污染物，严重影响我国空气质量，危害居民机体健康。

PM2.5是固体与液体混合的颗粒，具有粒径小而比表面积大的特征，易附着空气中的有害物质及有毒物质，组成非常复杂，主要包括：NO₃^-、SO₄^2-、NH₄⁺等水溶性无机离子，无机碳、有机碳、碳酸盐碳等含碳组分，脂肪烃、多环芳烃酮、多环芳烃等有机物成分，锌（Zn）、铅（Pb）、铜（Cu）、锰（Mn）、镍（Ni）等多种重金属元素以及花粉、细菌等生物组分。PM2.5中水溶性组分、金属元素及有机成分等均具有细胞毒性，可以降低细胞活性，促进炎症因子表达，同时引起氧化应激、免疫损伤，还可能致突变。皮肤作为机体最大的器官，是机体与外界环境之间的主要防御屏障，长时间暴露于环境 PM2.5容易受到损害。PM2.5附着在皮肤表面，其中一些脂溶性成分如多环芳烃（PAH）等，容易渗透进入皮肤，损伤皮肤屏障功能。

而芳烃受体（AHR），也称为二恶英受体，是一种配体依赖性转录因子，可被大量外源性和内源性环境因素激活，包括多环芳烃（PAHs）和卤代芳烃（HAHs或二恶英），以及源自L-色氨酸（L-Trp）分解代谢的代谢物。环境化学物如PM2.5，二恶英等可能通过AHR作用于多种信号通路，打破细胞稳态，导致氧化应激和炎症的发生，破坏皮肤屏障功能。

我们以发表在《Redox report : communications in free radical research》杂志上题目为“Lycium Barbarum polysaccharide protects HaCaT cells from PM2.5-induced apoptosis via inhibiting oxidative stress, ER stress and autophagy”的文章中抗污染功效部分进行举例说明：

枸杞多糖（Lycium barbarum，LBP）是从枸杞中提取的天然多糖，具有抗炎、抗细胞凋亡、抗衰老等作用。报道称LBP可通过调节Nrf2信号调节细胞内氧化应激水平，保护HaCaT细胞和人皮肤成纤维细胞（HSF）免受紫外线辐射的损伤。然而，枸杞多糖对PM2.5引起的损伤的保护作用尚不清楚。因此，该研究探讨了枸杞多糖对PM2.5诱导的HaCaT细胞损伤的保护作用及机制。

采用MTT法和LDH法测定细胞活力。结果显示，PM2.5可诱导细胞增殖抑制并导致细胞死亡，而LBP预处理可减轻PM2.5诱导的细胞毒性。此外，通过细胞形态学观察枸杞多糖对HaCaT的保护作用，枸杞多糖可显著改善PM2.5诱导的细胞形态学损伤。

图 1 细胞活力、细胞毒性测定及细胞形态的荧光显微镜分析

PM2.5诱导的HaCaT凋亡是加重细胞毒性、导致细胞损伤的重要因素，采用Annexin V-FITC和PI染色来评价其对细胞凋亡的影响。结果显示，PM2.5诱导的细胞凋亡率较高，LBP显著降低PM2.5诱导的细胞凋亡和细胞死亡。

图 2 细胞凋亡染色分析及阳性细胞统计

通过细胞内ROS水平、MDA含量和SOD活性评估氧化应激/损伤。采用DCFH-DA和DHE标记细胞内ROS，并在荧光显微镜下观察。结果显示，PM2.5诱导的细胞内ROS和MDA含量显著增加，SOD活性增强。活性氧（ROS）的产生增加是PM2.5对人体有害影响的主要机制之一。环境污染物多环芳烃等刺激AHR激活，从而上调细胞色素P450 1A家族的表达，通过解偶联机制导致ROS产生。ROS通过氧化脂质、蛋白质和核苷酸等重要生物分子损伤角质形成细胞，DNA损伤可通过增加基质金属蛋白酶表达和胶原蛋白降解来诱导衰老。

图 3 细胞内ROS荧光染色、ROS和MDA水平统计及SOD活性分析

PM2.5触发线粒体自噬，激活线粒体相关凋亡信号Bax/Bcl-2，但持续的线粒体自噬可能加重线粒体损伤，诱导细胞凋亡。利用GFP-LC3腺病毒和Mito tracker Red标记HaCaT细胞中的自噬体和线粒体，检测线粒体自噬过程。JC-1法测定线粒体膜电位。由图4可知，在PM2.5处理的细胞中可以明显观察到线粒体及自噬体的黄色点，表明PM2.5诱导了HaCaT细胞的线粒体自噬；PM2.5诱导的细胞内呈现大面积绿色荧光，线粒体膜电位显著降低，而自噬抑制剂3-MA可降低PM2.5诱导的细胞凋亡。

图 4 线粒体自噬过程及JC-1法测定线粒体膜电位

除文章内容以外，还可以通过测定AHR相关基因表达变化等手段进一步分析化妆品的抗污染功效。如图5所示，PM2.5诱导AHR表达，引起AHR核易位，与对照组相比，PM2.5处理的细胞和皮肤AHR染色强度显著增加。这些发现表明PM2.5可诱导角质形成细胞的AHR活化，当AHR响应配体激活从细胞质易位到细胞核时，多靶基因受到转录及表达调控，引起细胞氧化应激及炎症级联反应等损伤效应，从而加速细胞衰老，或引发各种病态反应。

图 5 AHR转位到细胞核的免疫荧光分析

待测活性物与BAP联合作用于EpiKutis® 皮肤模型后，形态学结果见图6。与空白对照组（Control）相比，刺激组（BAP）的角质层增厚、排列疏松、空泡明显且分化不完全；活细胞层（颗粒层、棘层、基底层）活细胞数目减少，基底层细胞空泡明显，排列疏散。

图 6 不同处理条件下表皮模型的形态学变化情况（放大40倍）

（a.空白对照组，b.BAP刺激组，c.待测活性物组）

PM2.5会在许多类型的细胞和组织中引起炎症反应，采用plex方法检测3D人体表皮模型的细胞因子和趋化因子表达谱。如图7所示，当3D人体表皮模型暴露于PM2.5时，CXCL1和IL-8水平显著升高。此外，PM2.5暴露还会导致TBARS含量增加，表明暴露于PM2.5会增强细胞脂质过氧化作用。

中性粒细胞是维持皮肤稳态的重要细胞：中性粒细胞被激活并迁移到伤口部位引起愈合反应。然而，中性粒细胞过度或不受调节的激活可能与炎症加剧有关。中性粒细胞在皮肤中响应趋化因子，特别是IL-8而迁移，因此研究表皮释放的趋化因子对中性粒细胞趋化性的影响。由图7-D可知，与未处理的表皮培养基相比，暴露于PM2.5的人表皮模型的条件培养基显著增强了中性粒细胞趋化性。

图 7 CXCL1和IL-8 mRNA、TBARS水平；中性粒细胞迁移试验

通过体外实验研究PM2.5对丝聚蛋白（FLG）和皮肤屏障功能的影响。该研究采用PM2.5刺激分化的角质形成细胞，并评估FLG的表达。如图8所示，FLG基因表达与单独培养基处理细胞相比显著降低。Th2细胞因子抑制FLG表达， IFN-γ上调FLG表达。Western blotting在蛋白水平上也证实了该结果。此外，PM2.5处理降低了大分子量形式的pro-FLG（>150 kDa）水平，但较小分子量的FLG（<150 kDa）受PM2.5处理影响较小，可能是由于PM2.5处理后pro-FLG没有足够时间进行完全的蛋白水解处理。

进一步评估PM2.5介导的FLG和表皮屏障功能的抑制作用，测定三维皮肤培养物经皮失水（TEWL）和FLG表达。H&E染色结果表明，PM2.5处理的皮肤培养物角质层分化程度低于对照组，而TEWL明显高于对照组。此外，与对照组相比，PM2.5处理的皮肤培养物中FLG染色强度显著降低。在分子水平上，这一过程由PM2.5诱导的TNF-α介导，多环芳烃与芳烃受体结合时激活芳烃受体（AHRs），然后诱导AHR向细胞核易位以调节细胞基因表达，导致经皮失水增加，皮肤FLG含量缺乏，随后引起皮肤屏障功能障碍。

图 8 PM2.5对角质形成细胞和皮肤模型中FLG及皮肤屏障功能的影响

图 9 PM2.5引起皮肤屏障功能障碍机理图

参考文献

1.Zhu S, Li X, Dang B, et al. Lycium Barbarum polysaccharide protects HaCaT cells from PM2.5-induced apoptosis via inhibiting oxidative stress, ER stress and autophagy. Redox Rep. 2022;27(1):32-44.

2.Kono M, Okuda T, Ishihara N, et al. Chemokine expression in human 3-dimensional cultured epidermis exposed to PM2.5 collected by cyclonic separation. Toxicol Res. 2022;39(1):1-13.

3.Fan L ,Wang H ,Ben S , et al.Genetic variant in a BaP-activated super-enhancer increases prostate cancer risk by promoting AhR-mediated FAM227A expression[J].Journal of Biomedical Research,2024,38(02):149-162.

4.Eui B K ,Jihyun K ,Elena G , et al.Particulate matter causes skin barrier dysfunction.[J].JCI insight,2021,6(5):